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更新 | GB 4789.9-2014 空肠弯曲菌检验及注意事项

发布时间：2024-05-27 浏览次数：252 分享：

空肠弯曲菌的生物学特性

生物学特性：弯曲菌属是一类耐热微需氧菌，革兰氏染色阴性。弯曲菌体弯曲如小逗点状，菌体两端相接时呈“S”形、螺旋状或海鸥展翅状，菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，无芽孢。弯曲菌包括17个种和8个亚种，引起人类感染致病菌的弯曲菌中80%~90%都是空肠弯曲菌。

流行学特征：空肠弯曲菌广泛分布于自然界中，是人畜共患致病菌微生物，人类感染主要是以食用生的、未彻底加热的禽肉和消毒不充分的牛奶为主，卫生较差的地区则以水源性传播多见。临床表现为急性或自限性肠炎，症状和普通肠炎类似，20%以上患者会出现病情复发或病程延长现象，严重者会并发格林-巴利综合征。

空肠弯曲菌的检验

操作注意事项

1：对易产生较大颗粒的样品（如肉类、贝类）进行检测时，建议使用带滤网均质袋，以便均质后用吸管吸取匀液；
2：检测含乳制品时，均质后后应检测pH值。如有必要，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调整pH值到7.5±0.2；
3：马尿酸钠水解实验和吲哚乙酸酯水解实验中，为保证实验结果的准确性，需要挑取培养状态良好的新鲜菌落，菌量应该足够大；
4：马尿酸钠水解实验中，加入茚三酮溶液后，不要震荡，36℃±1℃水浴或培养箱温浴10min后及时观察结果，不可放置时间太长，以免干扰结果判读；

培养基原理解析

1、Bolton肉汤

▶ 配方中乳白蛋白水解物、动物组织酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各种维生素；氯化钠维持均衡的渗透压；丙酮酸钠和偏亚硫酸氢钠能中和培养基的有毒物质，也能增强培养基的空气耐受力；a-酮戊二酸提供生长因子，促进空肠弯曲菌的生长；碳酸钠提供空肠弯曲菌最有利的酸碱环境；头孢派酮和多粘菌素B抑制革兰氏阴性菌；万古霉素和三甲氧苄胺嘧啶抑制革兰氏阳性菌；两性霉素B抑制酵母和真菌的生长。

2、改良CCD琼脂
▶ 配方中肉浸液、动物组织酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源、维生素、生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改变表面张力的作用；去氧胆酸钠为选择性抑菌剂；头孢哌酮可抑制普通肠道菌生长、两性霉素B 抑制酵母和真菌生长、利福平可抑制非弯曲菌其他厌氧菌。硫酸亚铁和丙酮酸钠有利于空肠弯曲菌的生长；琼脂是培养基的凝固剂。
▶ mCCD琼脂平板上的可疑空弯菌落通常为淡灰色，有金属光泽、潮湿扁平，呈扩散生长的倾向。

空肠弯曲菌为灰色菌落

3、Skirrow琼脂
▶ 配方中蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏提供碳、氮源、维生素、生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；丙酮酸钠、焦亚硫酸钠、硫酸亚铁有利于弯曲菌的生长。头孢呱酮可抑制革兰氏阴性细菌和部分革兰氏阳性菌、两性霉素B 抑制真菌生长、利福平可抑制非弯曲菌其他厌氧菌。琼脂是培养基的凝固剂。

空肠弯曲菌为灰色湿润单菌落或沿接种线扩散生长

4、哥伦比亚血琼脂
▶ 配方中动物组织酶解物、淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子；羊血是细菌生长繁殖的良好营养物质。在45～50℃的基础培养基中加入血液可以保存血液中某些不耐热的生长因子，同时血球不被破坏。庆大霉素能抑制肠杆菌科和铜绿假单胞菌的生长。

空肠弯曲菌为灰色湿润沿接种线扩散生长菌落

5、氧化酶试验
▶ 原理：氧化酶使细胞色素C氧化，氧化型细胞色素C再氧化对苯二胺试剂形成紫色复合物，产生颜色反应。
▶ 操作：滴加1滴氧化酶试剂到一小块洁净滤纸上，用玻棒或接种环（铂或塑料）挑取适量新鲜菌苔涂在试剂润湿的纸片上；30秒内出现蓝紫色为阳性，延迟反应或无颜色变化为阴性。

6、过氧化氢酶试验
▶ 具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
▶ 操作：挑取一环菌落培养物，加到在干净显微镜玻片上的一滴3％过氧化氢溶液中，如果在30秒内出现气泡则判定结果为阳性。

过氧化氢酶阳性

7、马尿酸钠水解试验
▶ 原理：细菌具有马尿酸钠水解酶，可将马尿酸钠水解为甘氨酸和苯甲酸，甘氨酸可与茚三酮反应生成紫色化合物。
▶ 操作：挑取欲检测的菌落培养物，加到盛有0.4mL 1％的马尿酸钠的试管中制成菌悬液，注意不要带入培养基琼脂。混合均匀后在37℃水浴中温育2 h或36℃培养箱中温育4 h。轻轻地在马尿酸盐溶液的顶部加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在37℃水浴或36℃培养箱中温育10 min后判读结果。若出现黑紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。

马尿酸钠水解试验阳性

8、吲哚乙酸酯水解试验
▶ 挑取欲检测的菌落培养物，加到羟基吲哚醋酸盐纸片上面，再滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解，则在5～10min内出现深蓝色；若没有颜色变化则表示水解反应没有发生。

吲哚乙酸水解试验阳性

空肠弯曲菌的生化特性

质量控制及疑难解析

质量控制

1、实验室过程中，每批预增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。

2、定期使用空肠弯曲菌ATCC33291或相应定量活菌参考品，在P2实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性实验验证，污染剂量应控制在10-100CFU/25g，并进行记录，验证实验至少每2个月进行1次次。

疑难解析

问：空肠弯曲菌在mCCDA琼脂的形态是否仅限于正文所述？还有无其他形态？
答：空肠弯曲菌在mCCDA琼脂平板上的形态与在Skirrow琼脂平板上相似，但也有可能出现2种形态，一种为有光泽、潮湿、扁平菌落，呈扩散生长的倾向，另一种为分散凸起、有金属光泽的单个菌落，直径约为1~2mm。

问：在前增菌或选择性增菌结束后，肉汤未见微生物生长，是否可以终止实验?
答：不可以，因为肉汤可见的细菌浓度为10⁷CFU/ml，在此浓度一下，肉眼不能发现微生物生长，但实际溶液中有微生物生长。

所需培养基试剂

用途	货号	名称	规格
增菌	C-43	圆底立式培养袋	10个/包
	C-2	2.5L 微需氧产气剂	10袋/包
	28025	0.1% 蛋白胨水	250g
	27380	Bolton肉汤基础	250g
	SR0340	Bolton肉汤配套试剂	10支/盒
	CP0570A	Bolton肉汤（含羊血，抗生素）	100mL×6瓶
	CP0571	Bolton肉汤（含羊血，抗生素）	225mL×6瓶
	CP0211	Bolton肉汤（含羊血，抗生素）	10mL×20支
筛选及纯化	27382	改良CCD琼脂基础	250g/瓶
	SR0320	改良CCD琼脂基础配套试剂	10支/盒
	CP0580	改良CCD琼脂平板	90mm×20/盒
	27385	Skirrow琼脂基础	250g/瓶
	SR0330	Skirrow琼脂配套试剂	10支/盒
	CP0590	Skirrow血琼脂平板	90mm×20/盒
	29010	革兰氏染色液	10mL×4瓶
	29170	氧化酶试纸	10片/盒
	24061	哥伦比亚血琼脂	250g/瓶
	CP0160	哥伦比亚血琼脂平板	90mm×20/盒
生化鉴定	29161	3%过氧化氢溶液	2mL×10支
	75770	马尿酸盐	20支/盒
	29231	茚三酮试剂	10mL/瓶
	SR0360	吲哚乙酸酯纸片	20片/盒

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