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基于较多小型实验室行业同仁对检验项目的一知半解，现分享一篇较全面的菌落总数测定培训教材，喜欢的小伙伴们得赶紧收藏我吆。

标准简介

现行有效的GB4789.2-2022是在2022年12月30号开始实施，在2022年6月30号发布的，与2016版相比，此版标准在检验程序上没有太大的变化，培养基和试剂方面新增了一个菌落总数测试片。

标准解读

检验菌种类：需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌。不含厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌。也不包括真菌，真菌有单独的检验方法。
菌落总测定是用于判定食品被细菌污染的程度和卫生质量，反应食品在生产过程中是否符合卫生要求。

3  设备和材料
      除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。

主要为细菌的培养提供恒定的温度
36℃是非水产类产品的培养温度，30℃是水产类的培养温度

3.2 冰箱：2℃~5℃。

用于试剂及菌株的保存

3.3 恒温装置：48℃±2℃。

用于对已灭菌但未用的固体培养基的保温（在此标准上指PCA，在大肠菌群标准上指结晶紫中性红胆盐琼脂）
温度可以在46℃～50℃之间，只要用时温度合适就行
2016版水浴装置：46℃±1℃，2022版修改为恒温装置，这就表示还可以用其他的恒温设备保存，例如恒温干燥箱。

3.4 天平：感量为0.1g。

称取培养基及样品称取，需单独两个天平，一个放准备室，一个放无菌室。

3.5 均质器。

对待检试样液的均质，使试样液的菌含量保持一致，包括匀浆机和拍打式均质器，匀浆机涉及到固体非粉末状样品，拍打式均质器适用于除固体非粉末状样品外的样品

3.6 振荡器。

与均质器作用相仿

3.7 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

用于试液转移，微量移液器需定期检定和灭菌，一次性吸头需湿热灭菌处理后烘干水分再使用（买一份移液枪能解放双手哟，就是耗材用得多）

3.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

盛装培养基及试样液，试样液可用均质袋替代

3.9 无菌培养皿：直径90mm。

玻璃培养皿灭菌需放入金属灭菌桶后选用恒温干燥箱171℃灭菌3小时及以上，一次性塑料无菌培养皿拆包装前需紫外杀菌15min以上（有些玻璃培养皿因材质问题，用久会发黄，不影响使用）

3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

仅用于自配培养基的pH调节，商用培养基基本上不需要调节pH值

3.11 放大镜或/和菌落计数器。

用于培养后的培养基进行菌落计数

加一个试管和配套试管塞（尺寸15*150mm）

用于盛装9mL稀释液，试管和试管塞需要湿热灭菌处理

4  培养基和试剂

4.1 平板计数琼脂培养基

主要培养基，成分适合细菌进行繁殖
如果是检一批五个样品，大概需要9.4gPCA+400mL水灭菌（以五个样品两个稀释度二十个平板+两个空白对照计算，每个平皿倒15-18mL培养基，用到330mL～396mL。倒培养基倒少了需注意保持培养箱的湿度，不然培养基会裂给你看）

4.2 菌落总数测试片

应符合GB4789.28中平板计数琼脂培养基质量控制要求,且主要营养成分与平板计数琼脂培养基配方一致。

4.3 磷酸盐缓冲液

成分较无菌生理盐水更科学合理，磷酸盐可在适宜范围内调节试样液本身pH，降低因样品本身的pH对实验造成影响，适用于酸类、碱类和高盐类样品的菌落计数。用前需湿热灭菌121℃持续15min（推荐用）

4.4 无菌生理盐水

较磷酸盐缓冲液优势为更易配制。用前需湿热灭菌121℃持续15min
如果是检一批五个样品，大概需要称11.9g氯化钠+1400mL水溶解分装（以225mL五个样品+9mL试管计算，1400mL能配5瓶225mL 0.85%生理盐水和30管9mL 0.85%生理盐水稀释液，能做到-6或-7梯度）磷酸盐缓冲液同理

5  检验程序

菌落总数的检验程序见图1。

6  操作步骤

除样品外所有操作需要使用的试剂耗材，必须灭菌，设备设施可采用紫外杀菌及75%浓度酒精擦拭后使用

6.1  样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1∶10的样品匀液。

25g样品：精确到0.1g，偏差25+0.2g，尽量不要偏差太大，可多不可少。
在标准无规定的情况下，最好按25g称样进行实验，这符合GB 4789.1中对抽样遵循代表性原则。当称样数量越少，代表性越差。
225mL稀释液：可使用灭菌后的量筒量取，也可以配制分装好后灭菌直接用（比灭菌后量取劣势为水分灭菌易挥发，导致稀释液浓度改变）。用哪种可自由选择，但特殊样品（酸类、碱类、高盐类）尽量使用磷酸盐缓冲液，避免样品本身pH造成实验误差。
均质器拍打：固体样品可选用均质器均质，使样液混匀；速溶类样品可不用均质器。
1:10样品匀液：1mL样液→9mL试管稀释液=10mL匀液，样液加入后可使用无菌吸管吹打（尽量不用，减少污染），也可摇匀，尽量使液体保持在试管口以下。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。

无菌玻璃珠：用于混匀样液与缓冲液

6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。

沿管壁缓慢注：可能在管壁残留细菌，需要震摇试管，将管壁上的试液混合于匀液中。若使用无菌吸头，可直接垂直于试管将试液打入稀释液中，不靠试管壁，吸头不入液面。
在样品菌落数范围未知/无法通过以往样品判断菌落数范围时，应多做几个稀释度。

6.1.4 按6.1.3操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

尽量避免稀释梯度之间的污染

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择1个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

根据以往的样品大概的菌含量预估样品的菌含量，适当选择2个~3个稀释梯度，可以选择2个稀释梯度，但必须有1个至2个梯度的菌含量在范围内
例：-1（皿1 皿2） -2（皿1 皿2） 空白（皿1 皿2）

6.1.6 及时将15mL~20mL冷却至46℃~50℃的平板计数琼脂培养基(可放置于48℃±2℃恒温装置如：恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

平板计数琼脂培养基温度需适宜，以不烫手为宜（水浴箱中拿出的培养基温度适中，可直接使用，无需冷却）。
有些样品为避免白色食物残渣在计数时的影响，会在PCA中加入TTC（各大培养基厂商有售无菌TTC溶液），使培养后的菌落呈红色。此项适用于食物残渣中含白色物质。
转动平皿使其混合均匀：平皿保持同方向，手拿平皿边缘按前后运动、左右运动、顺时针混匀，禁止培养基因大力转动造成溢出，培养基冷凝后方可倒置平皿培养。
本标准未规定称取至倒培养基的过程时间，一旦样品过多，尽量保持在20min之内。（标准没写，GB 4789.3中大肠菌群操作时间是15min，为的是避免过程中因时间过长导致细菌繁殖）

6.2  培养

6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。

倒置平皿培养，温度36℃±1℃，记录温度时需准确，不出现±符号。一般培养箱检定时会提供一个偏差值，需要在原有温度基础上修正偏差量
水产品培养温度比正常的样品要低，主要原因是水产品长期处于水中，生长环境温度较低。

6.2.2 如使用菌落总数测试片,应按照测试片所提供的相关技术规程操作。

6.3  菌落计数

6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits，CFU)表示。

CFU指单个培养皿的菌落个数。

6.3.2  选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7  结果与报告

7.1 菌落总数的计算方法

7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中菌落总数结果。

7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算：

7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均＜30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均＞300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU 之间,其中一部分＜30CFU 或＞300CFU 时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.2 菌落总数的报告

7.2.1 菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。

菌落数指计算后的结果，即公式（1）中的N
例如计算结果为35CFU/(g)mL，则报35CFU/(g)mL，不需要再修约。

7.2.2 菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用 0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。

例如计算结果为3540，则报3500CFU/(g)mL或3.5×103CFU/(g)mL

7.2.3 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。

空白对照长菌，证明环境/试剂/工具有污染。
此条可理解为当空白对照没长菌落时，可以用“未检出”表示

7.2.4 称重取样以 CFU/g为单位报告,体积取样以 CFU/mL为单位报告。

附录A
培养基和试剂

A.1 平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基

A.1.2 制法

将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH 至7.0±0.2。分装试管或锥形瓶,121 ℃高压灭菌 15min。

有商品化脱水培养基，不用自行调节pH，可直接使用，有效避免自配产生的误差。
其中样品为白色或偏白色时，培养基中可添加1%的无菌TTC进行菌落着色，着色后菌落为红色。
煮沸溶解：适用于自配培养基，商品化脱水培养基可不进行此操作（灭菌前需分装的培养基除外）

A.2 磷酸盐缓冲液

贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶 液调节pH 至7.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。

A.2.2 制法
稀释液：取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15min。

有商品化脱水培养基，直接使用，有效避免自配产生的误差。

A.3 无菌生理盐水

A.3.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15min。 

菌落总数原始记录参考模板

参考资料：
1. GB 4789.2-2022 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定
2.中华人民共和国卫生健康委员会官网
3.T/LZZLXH 033-2020 实验室产品检测全流程记录管理指南
4.DB51/T 2163-2016 实验室样品记录及检测记录管理指南
5.微生物检验方法食品安全国家标准实操指南
6.《寒烟脆》公众号文章（2022年4月30日）