国际主流大肠菌群计数标准关键环节差异化分析
发布时间：2024-02-28 浏览次数：172
来源：“六扇门Study”公众号，作者~SIXDoors
去年，小六对比了GB4789.3 -2016版、GB4789.3征求意见版、ISO方法、美国FDA/BAM方法在不同操作环节的差异，现跟小伙伴们一起复习一下！
不同标准主要差异汇总及分析
大肠菌群计数有两种方法：MPN法和平板计数法。一般情况，MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。平板计数法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
MPN法各标准差异不大，主要体现在前处理和培养温度上，小伙伴们可查阅上图，小六接下来主要针对“平板计数法”各环节进行比较分析哈。
1、样品前处理环节
采样量上，GB为25g+225mL，BAM法为50g+450mL，ISO方法有专门的样品前处理指南，不同类型的样本采样量和处理方法都不同，多数为25g+225mL。
小六观点，
采样量大必然会提高检出率，对产品控制更严格，但同时也需要结合国家食品安全整体管理思路和实际可操作性综合考虑。
2、接种环节
新版GB4789.3征求意见稿中：倾注15mL~20mL，为防止菌落蔓延，待琼脂凝固后，可再均匀覆盖 3 mL～4 mL VRBA 到整个平板表面。
小六观点，
相比2016版本，“匀覆”不是必要操作，使用者可根据实验室样品的情况来选择，更为灵活，可提高效率并降低成本。
并要求从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。
BAM标准的操作为：10mL（先倒）+5mL（覆盖，防止细菌蔓延）；如果细胞受损需要修复，取8-10mL冷却48℃的胰蛋白胨大豆琼脂将样品液与其混合，室温放置2±0.5h，再加入8-10mL冷却至48℃的VRBA覆盖。
ISO4832-2006标准为：15mL（先倒）+4mL（覆盖，防止细菌蔓延），并要求倾注时间控制在15min内完成。
小六观点，
BAM标准充分考虑了加工过程样本中受损严重菌的修复，标准考虑到了从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min，主要是考虑到肠杆菌科类细菌繁殖周期20分钟。
3、培养条件
新版GB4789.3征求意见稿中增加了乳制品的培养温度为“30 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h”，其中BAM标准为32℃，ISO标准为30 °C。
其中ISO标准平板计数法和MPN法乳制品的培养温度都要求为“30 °C”。
国内外文献报道，培养温度为 30 ℃时乳制品中大肠菌群平板计数的结果，显著高于培养温度为 36 ℃的计数结果。本次国标修订，起草组经调查研究和实验验证，试验验证发现，对于自然污染大肠菌群的生乳，无论是使用VRBA平板计数还是测试片计数，培养温度为30 ℃的计数结果均高于36 ℃。经统计学分析发现，差异都有极显著性意义。
小六比较好奇，
是乳制品基质中有特定的“优势菌群”跟其他食品不同？这部分菌的最适生长温度是30 ℃？
还是生乳经过生产加工过程，菌受损且生产环境温度低，培养温度过高，不利于菌株的复苏和生长？
欢迎小伙伴们发言讨论！
4、确证实验
新版GB4789.3征求意见稿中要求“从同一稀释度的 VRBA平板上挑取典型和可疑菌落各 5 个，少于 10 个者，则挑取其全部菌落。”并给出了可疑菌落和典型菌落的描述。同时增加了附录D，结果计算示例，方便使用者参考。
2016版本是挑取10个不同类型的典型和可疑菌落；BAM标准是挑取10个典型菌落；ISO标准是至少挑取5个典型菌落。
小六观点，
本次国标修订在这一点上立足标准实际应用者的视角，对如何挑菌验证有详细规定，对典型和非典型菌落要分开验证，并且给出了菌落形态的具体描述，方便一线操作者对照，可以大大提高检验的质量和效率。
5、增加了“测试片”法
新版GB4789.3征求意见稿中提到“8.2.3 若采用大肠菌群计数测试片，则按其说明进行操作”。这是继GB4789.2后又一标准增加了“测试片”！
小六观点，
小六看编制说明，修订组是在参考大量的国际标准并进行了充分的实验室内和实验室间验证后，增加了测试片的并行准入。
同时，测试片是商品化即用型的培养基系统，无需进行培养基制备，配方标准化，操作简单，不需进行复发酵实验且判读直观方便，一般培养18-24h即可出结果，大大提高了实验人员的工作效率。小六觉得测试片的这些特点是修订组考虑将其纳标准的主要因素，立足标准使用者的实际需求，提供方便简化操作的可选方案。
标准修订者在某次大会上也介绍了标准对测试片性能的要求：
标准中对大肠菌群计数测试片规定了性能要求：应以发酵乳糖产酸产气为阳性结果判断为依据，也就是测试片上必须是有气泡哦。同时其性能要符合GB4789.28中相关培养基的质量要求。
以上仅代表小六的分析哈，欢迎小伙伴们补充观点！
