鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验
发布时间：2022-07-11 浏览次数：3924 分享：
摘 要：本试验从一群糊肛严重、死淘率和跛脚鸡高达2%的鸡群中，随机挑精神状态差、瘦小、糊肛严重、跛脚的鸡若干，采集其肝脏和关节进行沙门氏菌的分离与鉴定。成功分到10株鸡白痢沙门氏菌，其中6株源自肝脏，4株源自关节；药敏试验结果表明，10株鸡白痢沙门氏菌对头孢噻呋钠、卡那霉素、庆大霉素、硫酸新霉素、复方磺胺氯达嗪和氧氟沙星可溶性粉均表现出高度敏感，但对阿莫西林、氨苄西林可溶性粉、盐酸林可霉素、酒石酸泰乐菌素、盐酸土霉素可溶性粉等呈多重耐药。因此，对鸡白痢沙门菌的治疗应根据药敏试验结果筛选敏感药物指导临床科学合理用药。
关键词：鸡白痢沙门氏菌；分离鉴定；耐药性
鸡白痢沙门氏菌具有宿主高度适应专一性的特点，引起雏鸡精神萎靡、下痢甚至死亡，发病率和死亡率都很高；成年鸡亦可被感染，常导致产蛋率、孵化率和出雏率下降，是严重危害养鸡生产的重要疾病之一［12］。我国自20世纪80年代便开始实行大规模鸡白痢净化方案，但因各鸡场规模、品种、基础设施和人员素质参差不齐，导致白痢阳性率居高不下［3］。此外，我国地方品种鸡和黄羽肉鸡白痢抗体水平显著高于引种鸡和培育蛋鸡品种，由于抗体阳性率与病原阳性率并不一致，即使种鸡场采用淘汰抗体阳性鸡的措施来防控鸡白痢，效果也并不显著，而药物治疗极易产生耐药性［45］，因此，鸡白痢沙门氏菌给鸡场健康养殖造成极大困扰。
本研究从一群死淘率和跛脚率均较高的竹丝鸡中分离并鉴定沙门氏菌，通过药物敏感性试验筛选敏感药物，为生产上查找鸡群前期死淘率和跛脚率较高的原因以及指导临床用药提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 病料来源
前期死淘率和跛脚率较高的竹丝鸡，无菌采集精神状态差、瘦小、糊肛严重、跛脚鸡的肝脏和关节。
1.2 培养基和试剂
亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、沙门氏菌属显色培养基、XLT4琼脂培养基、麦康凯营养琼脂、沙门氏菌的生化鉴定盒等均购自广东环凯生物科技公司；Ex Taq 酶购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；氨苄西林可溶性粉购自拜耳（四川）动物保健有限公司，氟甲喹购自河北远征药业有限公司，盐酸林可霉素、复方磺胺嘧啶混悬液和氧氟沙星可溶性粉购自江苏恒丰强生物技术有限公司，头孢噻呋钠、阿莫西林可溶性粉等16种药物均购自广东温氏大华农生物科技有限公司。
1.3 细菌分离
无菌取竹丝鸡的肝脏和关节，剪碎后分别接至亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）37 ℃增菌培养24 h，取一环增菌液划线接种于沙门氏菌属显色培养基，置 于37 ℃培养18 h，挑取疑似沙门氏菌的单菌落分别接种于XLT4培养基、SS培养基和麦康凯琼脂培养基进行纯化培养，观察菌落生长情况和形态。
1.4 革兰氏染色
取纯化好的单菌落以适量生理盐水稀释，将菌悬液涂片固定后，滴加结晶紫初染1 min，水洗；碘液媒染 1 min，水洗；酒精脱碘 30 s，水洗；蕃红复染1 min，水洗；晾干，于显微镜下观察细菌的形态。
1.5 生化鉴定
取适量菌液分别接种于沙门氏菌的生化鉴定管中（三糖铁、蛋白胨水、尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、甘露醇、山梨醇、β半乳糖苷、卫矛醇），37 ℃培 养24 h后观察并记录结果。
1.6 PCR鉴定
根据鸡白痢沙门氏菌特异性引物进行PCR扩 增［6］，20 μL 反应体系：Ex Taq 酶 10 μL，无菌水8 μL，上下游引物各0.5 μL，菌液1 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延 伸 30 s，30 个 循 环 ；72 ℃ 后 延 伸10 min。PCR反应结束后将产物以3%琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增产物目的片段为161 bp。
1.7 药敏试验
取鉴定后的鸡白痢沙门氏菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤中，37 ℃恒温振荡培养18 h后，取细菌悬液均匀涂布在TSA营养琼脂培养基上，采用牛津杯法对21种药物进行药敏试验，37 ℃培养16～18 h量取抑菌圈。
2 结果
2.1 细菌分离结果
分离株在沙门氏菌显色琼脂培养基上长成圆形、光滑突起的紫红色菌落，在XLT4琼脂培养基上呈圆形、无色透明的菌落，在SS琼脂培养基上长出圆形、光滑、无色半透明的菌落，在麦康凯培养上显现圆形、光滑、露珠状、无色透明的菌落。分离菌株经革兰氏染色后，在油镜下观察到两端钝圆的红色短小杆菌，呈革兰氏阴性（图1，图见第52页）。
2.2 鉴定结果
生化试验结果表明分离株在三糖铁琼脂（TSI）试验中均产酸、斜面变红，蛋白胨、尿素、氰化钾、山梨醇、卫矛醇和β半乳糖苷酶试验均为阴性，甘露醇和赖氨酸脱羧酶试验阳性，参照生化鉴定试剂盒说明书判断所有分离株均为沙门氏菌；将分离株进行鸡白痢沙门氏菌特异性 PCR 扩增，分离株均能扩增到目的片段（图2）；综合生化试验和PCR鉴定结果，本研究从病鸡肝脏和关节样品中共分离鉴定 10 株鸡白痢沙门氏菌，其中 6 株分离自肝脏、4株分离自关节。
2.3 10药敏试验结果
株鸡白痢沙门氏菌对21种药物的敏感性判定参照美国临床实验室标准化委员会（ NCCLS，2009）公布的标准。结果表明：10株鸡白痢沙门氏菌对头孢噻呋钠、卡那霉素、庆大霉素、硫酸新霉素、复方磺胺氯达嗪和氧氟沙星可溶性粉均表现出高度敏感，对阿莫西林、氨苄西林可溶性粉、盐酸林可霉素、酒石酸泰乐菌素、盐酸土霉素可溶性粉等均耐药，对其余 10 种药物的敏感性具有差异（表 1）。
3 讨论
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的一种急性系统性疾病，传染速度较快、发病率高，可引起种蛋受精率、孵化率和健苗率降低，死胚率、弱胚率和弱雏率升高，还可导致继发感染或混合感染［7］，严重制约养鸡业的健康发展。目前国内鸡白痢沙门氏菌并无有效的商品化疫苗，国内种鸡场主要采用抗菌药物结合定期检疫淘汰阳性鸡的方法进行鸡白痢的防控［8］，但不同场的防控效果具有较大差异，且长时间使用抗生素药物容易导致耐药性和药物残留等问题。
本研究通过细菌分离纯化、染色镜检、生化试验和特异性PCR鉴定，成功从糊肛、跛脚、精神状态差的竹丝鸡中分离出10株鸡白痢沙门氏菌，其中6株分离自肝脏，4株分离自肿胀的关节。药敏试验结果表明，所有分离株对头孢噻呋钠、卡那霉素、庆大霉素、硫酸新霉素、复方磺胺氯达嗪和氧氟沙星可溶性粉6种药物均高度敏感，在临床用药时可作为首选，而对阿莫西林、氨苄西林可溶性粉、盐酸林可霉素、酒石酸泰乐菌素、盐酸土霉素可溶性粉具有多重耐药性，对其他10种药物的敏感性各菌株具有一定差异。由于各鸡场和各地区用药习惯和用药频率不同，导致药敏试验结果存在一定的差异［910］。因此，根据药敏试验结果选择敏感药物，通过交替和轮换使用抗菌药物，再配合科学的饲养管理，对临床科学合理用药具有重要的指导意义。
Guo等（2019）报道从跛脚、患有细菌性关节炎的商品鸡中分离鉴定鸡白痢沙门氏菌，并成功复制关节炎病例，说明病原的多样化程度越来越高，一些新型沙门氏菌能够诱发鸡关节炎［11］。本研究中鸡群早期跛脚率高、死淘严重是否由于感染关节型还是肝脏型鸡白痢沙门氏菌引起，还需要后期通过动物试验进行验证。
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来源：广东畜牧兽医科技
原文标题：2021年度“永顺杯”——鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定与药敏试
