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GB 8538饮用天然矿泉水检验方法 征求意见稿(微生物检验方法)

发布时间:2020-10-20    浏览次数:460

      8月31日下午,国家卫健委发布《食品安全国家标准审评委员会秘书处关于征求食品中污染物限量等16项食品安全国家标准(征求意见稿)意见的函》。其中GB8538征求意见稿对现行矿泉水标准的微生物检测部分做了大量的补充和修正,比如:提及的培养温度和培养时间缺少波动范围,检验方法中列出的设备与材料、培养基和试剂内容与操作步骤中提到的不一致,检测程序图与操作步骤不一致;附录 A:标题与内容不完全对应,培养基 pH 值缺少波动范围, 部分培养基成分错误等问题; 附录 B: 表 B.1 中微生物测定项目有误,且微生物检样采样体积不符合要求。涉及大肠菌群、粪链球菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌4个微生物检测项目。

      下面我们把微生物检验各检测项目的修订情况汇总,如下表1/2/3/4:

表1 大肠菌群检验

方法

序号

现行标准

在意见稿中修改的内容

修改说明

1

设备材料规格不全或者同具体操作不对应

增加无菌试管规格35 mm×200 mm或其他适宜规格、无菌小倒管规格6 mm×30 mm、13 mm×100 mm或其它适宜规格;增加无菌吸管项代替现行无菌定量分装器;增加pH计或pH比色管或精密pH试纸项;删除电子天平、显微镜、电炉项。

一般性修订:检验设备更加完善,且适用于具体操作步骤。

2

矿泉水水源水推测性检测水样量为10mL、1mL、0.1mL各5管。MPN表为总接种量为55.5mL对应的MPN表

矿泉水水源水检测修改为15管发酵法,同时修改推测性检测水样量为100mL、10mL、1mL各5管。修改MPN表为总接种量为555mL对应的MPN表。

检验方法的重大修订:增加检测水样量,减少由于水样取样量太少导致的结果不具有代表性,使结果更加准确。

3

直接饮用矿泉水检测方法是5管MPN法,MPN表是5管MPN表

直接饮用矿泉水检测方法修改为6管发酵法,在原标准的5管10mL接种量基础上增加1管50mL接种到50mL双料培养基步骤,共6管;修改对应MPN表从5管MPN表修订为6管MPN表。

4

推测性实验的培养时间为25h,确证性培养时间为48h

推测性实验培养时间改为24±2h,确证性实验培养时间改为48±2h。

一般性修订:增加温度范围,修改更加合理。

5

确证实验用到的亮绿乳糖胆盐培养液(BGLB)的装量没有体现

明确亮绿乳糖胆盐培养液的装量为10mL。

一般性修订:指定装量,检验更明确。

6

设备材料不全

无菌滤膜修订为无菌亲水性微孔滤膜;无菌抽滤设备修订为过滤设备;增加培养箱、显微镜、冰箱、pH计项目;培养基增加无菌生理盐水、无菌磷酸盐缓冲液、营养琼脂项。

一般性修订:材料设备更加全面,文字描述更加规范。

7

没有滤膜法检验流程图

增加滤膜法检验流程图。

一般性修订:检验流程表格化,清晰明白

8

没有指定稀释液种类

明确水样稀释液为无菌生理盐水或者无菌磷酸盐缓冲液。

一般性修订:指定具体培养基,检验更明确。

9

滤膜法确证实验挑取可疑菌落数为3个(不足3个全挑)

按比例挑取10个不同形态的可疑菌落(不足10个则全挑)。

较大修订:增加确证实验挑菌数,使结果更具代表性。

10

没有菌落纯培养过程

增加可疑菌落在营养琼脂上的纯培养过程。

一般性修订:避免选择性平板的菌落会影响生化鉴定结果;同时有助于分离出单菌落,便于下一步鉴定。

11

计算方法简单

计算方法增加确证菌同可疑菌的比值,同时计入稀释因子。

较大修订:计算方法更加科学合理。

表2 粪链球菌检验

序号

现行标准

在意见稿中修改的内容

修改说明

1

设备材料不全,表述不规范,培养基种类不全

无菌滤膜修改为无菌亲水性微孔滤膜,无菌抽滤修订为过滤设备,修改无菌刻度吸管项为无菌吸管,修改无菌培养皿为无菌平皿直径:90mm;删除无菌量筒、无菌试管、高压蒸汽灭菌器、酒精灯项。冰箱温度改为2-8℃;培养基脑-心浸萃液态培养基、脑-心浸萃琼脂培养基修为脑心浸液液态培养基、脑心浸液琼脂培养基;增加无菌生理盐水、无菌磷酸盐缓冲液、革兰氏染色液、3%过氧化氢溶液、胆汁液态培养基。

一般性修订:设备材料更加完善,文本表述更规范具体,补充整个实验过程涉及到的培养基。

2

推测性实验的培养时间为48h

推测性实验培养时间改为48±2h。

一般性修订:增加温度范围,修改更加合理。

3

滤膜法确证实验挑取可疑菌落数为不少于5个(不足5个全挑)

按比例挑取10个不同形态的可疑菌落(不足10个则全挑)。

较大修订:增加确证实验挑菌数,使结果更具代表性。

4

直接挑取KF平板可疑菌落染色镜检

挑取KF平板可疑菌落在脑心浸液琼脂平板后纯培养后再染色镜检。

一般性修订:纯培养后的染色镜检结果更可靠,且方便后续的生化鉴定。

5

过氧化氢酶实验没有规定3%过氧化氢滴加量以及滴加后的气泡观察时间

明确滴加3%过氧化氢溶液2-3滴,同时观察明确时间30s。

一般性修订:明确具体检验。

6

用接种环从脑-心浸萃琼脂培养基上转移一环培养物到脑-心浸萃液态培养基内,在45 ℃培养48h。此外,也同时转移一环培养物到胆汁液态培养基中

用接种环从脑心浸液琼脂培养基平板上挑取单菌落到脑心浸液液态培养基内,在45 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。同时挑取单菌落到胆汁液态培养基中 。

一般性修订:意见稿修改一环培养物为单菌落,同时增加温度时间范围,检验流程更加科学,表述更加规范。

7

结果报告没有给出具体的计算方法

明确给出计算公式

较大修订:计算公式更加科学。

表3 铜绿假单胞菌检验

序号

现行标准

在意见稿中修改的内容

修改说明

1

设备材料方面不全

增加“无菌滤器、过滤设备、无菌无齿镊子、无菌平皿、pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸”。

一般性修订:检验设备更详尽。

2

铜绿假单胞菌未指明具体的水样稀释液

水样稀释液明确为“无菌生理盐水”或“无菌磷酸盐缓冲液”。

明确稀释液及强调无菌要求。

3

可疑菌落分别计数后,没有明确是否需接种营养琼脂纯化后再做生化确证

明确了可疑菌落计数后接种营养琼脂分纯培养后,再进行生化试验。

一般性修订:分纯一方面方便可疑菌落的保存,另一方面分纯后的可疑菌落是经过扩繁的,后续生化实验不用担心可疑菌落不够用或者接种量少影响试验结果。

4

未明确哪些可疑菌落需进行绿脓菌素试验确证

明确只是滤膜上所有显蓝色和绿色的菌落需进行绿脓菌素试验确证。

一般性修订:在CN上非蓝/绿色菌落,不一定产绿脓菌素特征,所以明确绿脓菌素确证只是针对蓝/绿色菌落。

5

发荧光非蓝色或非绿色菌落需进行产氨试验确证。

发荧光非蓝色或非绿色菌落除了做产氨试验外,还增加了42℃生长试验。

较大修订:由于荧光假单胞菌42℃不生长,因此,该试验可区分荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌。

6

在100级洁净工作台进行过滤操作

删除在100级洁净工作台进行过滤操作的要求。

一般性修订:由于过滤操作需洁净环境操作即可,且过滤系统放在超净工作台中,不方便操作,因此,不强制要求在100级洁净工作台进行过滤操作。

7

CN琼脂培养时间:24-48h

CN琼脂培养时间修改为20-48h。

一般性修订

8

产氨试验无观察时间要求

产氨试验,明确添加钠氏试剂需10s内观察结果。

一般性修订:滴加试剂后,延长观察时间会有假阳性。

9

菌落计算公式

菌落计算公式修改为

较大修订:根据确证试验项目修改进行相应的修改。

10

阴性对照菌株为荧光假单胞菌

阴性对照菌株更改为恶臭假单胞菌。

较大修订:部分荧光假单胞菌在37℃的条件下不生长。

表4 产气荚膜梭菌检验

序号

现行标准

在意见稿中修改的内容

修改说明

1

设备材料:滤膜孔径:0.22μm

方法提要:滤膜孔径:0.45μm

滤膜孔径:0.45μm

一般性修订:明确滤膜孔径为0.45μm ,GB 8538各菌检验使用0.45μm规格的滤膜即可完成GB 8538的各项微生物检验。

2

计数培养基:SPS

计数培养基:TSC

检验方法的重大修订:TSC为GB 4789及FDA检验产气荚膜梭菌所采用的培养基,与SPS相比,产气荚膜梭菌在TSC上产生黑色中心的效果优于SPS。

3

过滤完成后滤膜放置于培养基后即可培养

过滤完成后新增操作:倾注5 mL-10 mL冷却至50℃的TSC琼脂均匀覆盖滤膜表面。

检验方法的重大修订:倾注一层薄培养基覆盖滤膜不影响菌落挑取,菌落处于培养基内部的话,菌落产黑的特征更优。

4

确证试验包含卵磷脂分解试验

确证实验删除卵磷脂分解试验,增加了乳糖-明胶试验。

检验方法的重大修订:部分巴氏梭菌在含铁牛奶培养基上也呈暴烈发酵的现象,乳糖明胶试验可以区分。此外,一些产气荚膜梭菌磷脂酶活性较弱,可能会造成卵磷脂分解试验假阴性的情况。

5

阴性对照菌株:绝对厌氧菌

阴性对照菌株:艰难梭菌

较大修订:绝对厌氧菌株包含艰难梭菌、生孢梭菌等多种菌株,修改后明确为艰难梭菌,给予了实验人员明确的指示。

6

无计算公式

结果报告新增计算公式

一般性修订。

7

培养基和试剂:

动力-硝酸盐培养基(B法)

动力-硝酸盐培养基(B法)

确证实验:动力-硝酸盐培养基

培养基和试剂:缓冲动力硝酸盐

确证实验:明确动力试验及硝酸盐还原试验采用缓冲动力硝酸盐培养基,新增操作“如果不出现颜色变化,则加少许锌粉,放置 10 min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。

一般性修订。

8

可疑菌落的挑取数量:3-5个

可疑菌落的挑取数量:按比例挑取 10 个不同形态的可疑菌落(不足 10 个则全挑)。

较大修订:增加确证菌落数。

大肠菌群检验用培养基试剂列表

方法

货号

名称

类别

规格

配制量 g/L

单瓶/盒可配制液体量 L

多管发酵法

CP0311D

单料乳糖胆盐发酵培养基

试管(盒)

10ml×20/

CP0311A

双料乳糖胆盐发酵培养基

试管(盒)

10ml×20/

022040

乳糖胆盐发酵培养基

干粉(瓶)

250g

35

单料7.14

双料3.57

022040P1

乳糖胆盐发酵培养基(颗粒型)

颗粒(瓶)

250g

35

单料7.14

双料3.57

022190

亮绿乳糖胆盐培养液(BGLB)

干粉(瓶)

250g

40

6.25

滤膜法

022117

磷酸盐缓冲液

干粉(瓶)

250g

41

4872

022150

远藤琼脂培养基(品红亚硫酸钠培养基)

干粉(瓶)

 250g

54.5

4.59

C22200G1

单料乳糖蛋白胨发酵管

试管(盒)

10ml×20/

022200

乳糖蛋白胨培养液

干粉(瓶)

 250g

23

10.86

022020

营养琼脂

干粉(瓶)

250g

33

7.57

024089

营养琼脂平板

盒(平板)

90 mm×20

029010

革兰氏染色液

检测配套试剂(盒)

10ml×4/

粪链球菌检验用培养基试剂列表

货号

名称

类别

规格

配制量 g/L

单瓶/盒可配制液体量 L

028350

KF链球菌琼脂培养基

干粉(瓶)

100g

71.5

1.39

024053P1

脑心浸出液肉汤(颗粒型)

颗粒(瓶)

100g

36

2.77

024053A

脑心浸出液肉汤BHI

试管(盒)

10ml×20/

024053

脑心浸出液肉汤(BHI)

干粉(瓶)

100g

36

2.77

029161

3%过氧化氢溶液

生化管(盒)

10/

028365

胆汁液态培养基

干粉(瓶)

100g

41

2.43

022020

营养琼脂

干粉(瓶)

250g

33

7.57

024089

营养琼脂平板

盒(平板)

90 mm×20

029010

革兰氏染色液

检测配套试剂(盒)

10ml×4/

ATCC 29212

粪链球菌

冻干菌株

ATCC 25922

大肠埃希氏菌

冻干菌株

铜绿假单胞菌检验用培养基试剂列表

货号

名称

类别

规格

配制量 g/L

单瓶/盒可配制液体量 L

027053

假单胞菌琼脂基础培养基(CN琼脂)

干粉(瓶)

250g

52.6 g/L

4.75

SR0230

萘啶酮酸(CN琼脂配套试剂)

生化管(盒)

10/

每支添加于100 mL基础培养基中

1.00

027054

假单胞菌琼脂基础培养基(CN琼脂)

已包含萘啶酮酸产品

干粉(瓶)

250g

52.6 g/L

4.75

029080

甘油(CN琼脂需添加配套试剂)

生化管(盒)

10/

每支加于100 mL CN琼脂基础培养基中

1.00

CP0420

假单胞菌琼脂(CN琼脂)平板

成品(平板)

90 mm×20

027052

金氏B培养基

干粉(瓶)

250g

38 g/L

6.58

029080

甘油(金氏B需添加配套试剂)

生化管(盒)

10/

每支添加于100 mL金氏B基础培养基中

1.00

022020

营养琼脂

干粉(瓶)

250g

33g/L

7.57

024089

营养琼脂平板

盒(平板)

90 mm×20

075800

乙酰胺肉汤

生化管(盒)

20/

029229

纳氏试剂

检测配套试剂(盒)

029170

氧化酶试纸

生化管(盒)

10/

产气荚膜梭菌检验用培养基试剂列表

货号

名称

类别

规格

配制量 g/L

单瓶/盒可配制液体量 L

028020

胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)

干粉(瓶)

100g

42.0

2.38

SR0290

胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)脂配套试剂

检测配套试剂(盒)

10/

100ml1

1.00

028030

液体硫乙醇酸盐培养基(FT)

干粉(瓶)

250g

29.3

8.53

075810

缓冲动力-硝酸盐

生化管(盒)

20/

029070

硝酸盐还原试剂(甲液:对氨基苯磺酸)(乙液:甲萘胺)

检测配套试剂(盒)

10ml×2/

075850

乳糖明胶

生化管(盒)

20/

028035

含铁牛奶培养基

干粉(瓶)

250g

200

1.25

028025

0.1%蛋白胨水

干粉(瓶)

250g

1

250

029010

革兰氏染色液

检测配套试剂(盒)

10ml×4/