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食品微生物检验GB4789.4-2016 沙门氏菌检验及注意事项

发布时间:2020-09-21      浏览次数:5457    分享:

一、沙门氏菌生物学特性

      生物学特性:沙门氏菌属是食源性细菌性肠胃炎的首要病原菌,属于肠杆菌科,革兰氏阴性无芽孢杆菌,营养需求不高,需氧或兼性厌氧。典型菌株多具有周生鞭毛、能运动(除鸡瘟沙门菌和鸡沙门菌外)、大部分菌株产H2S、能分解葡萄糖并产气,最适培养温度为37℃,最适pH 7.2~7.6。耐受胆盐,在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。

      血清型:沙门菌属由两个种组成:肠道沙门菌(S.enterica)和邦哥沙门氏菌(S.bongori)。目前已知沙门氏菌血清型有2500多种,

      流行学特征:引起食物中毒最常见的沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌。而易引起沙门氏菌中毒的食品则有肉、蛋、乳类等。

二、沙门氏菌的检验

三、培养基原理解析

      1. 缓冲蛋白胨水(BPW)

      •其成分中含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钠,起缓冲液的作用;

      •蛋白胨提供生长营养,有利于损伤沙门氏菌的复苏。

      2. 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)

      •配方中硫代硫酸钠和碘经氧化生成四硫磺酸钠,它对大肠菌群有抑制作用,对沙门氏菌无影响(因沙门氏菌具有四硫磺酸酶,能分解四硫磺酸钠,而大肠菌群没有这种酶,故生长受抑制);

      •碳酸钙为缓冲剂,可使沙门氏菌不致因酸碱度改变面死亡。

      •由于配方含碳酸钙,因此,该培养基配置后的最终pH不在7.0±0.2,而是偏碱性。

四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)

      3. 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

      •蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;乳糖是可发酵的糖类;亚硒酸氢钠抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰氏阴性肠道菌;磷酸盐是缓冲剂;L-胱氨酸为还原剂。

      •使用过程中要注意SC培养基不稳定,配置时避免过度加热。

亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

      4. 亚硫酸铋琼脂培养基(BS)

      •配方中亚硫酸钠可与柠檬酸铋铵生成亚硫酸铋,抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群;硫酸亚铁可产生硫化氢,并与铁反应生成黑色沉淀。

      •沙门氏菌在BS上的典型菌落特征:具有金属光泽的棕色或黑色菌落。但有些菌株形成非典型菌落特征:灰绿色的菌落,周围培养基不变。

      •BS平板应制备后避光常温保存,并在24h内使用。

亚硫酸铋琼脂(BS)菌落特征

      5. HE琼脂培养基

      •配方中胆盐、去氧胆酸钠、溴麝香草酚兰等成分可抑制革兰氏阳性菌生长;酸性复红作为酸碱指示剂的同时,也可抑制阳性菌,但对阴性肠道菌无抑制作用,选择性较弱。硫代硫酸钠可被细菌还原产生硫化氢,与柠檬酸铁铵反应生成黑色硫化亚铁。

      •菌落特征:蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或全几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。

HE琼脂菌落特征——鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028

      6. XLD琼脂培养基

      •配方中木糖、乳糖和蔗糖成分作为可发酵的碳源,除志贺氏菌外,其他大多数肠杆菌均能发酵木糖;沙门氏菌发酵木糖产酸,形成酸性环境有利于产生脱羧酶使赖氨酸脱羧,从而使培养基的pH值升高向碱性转变;在碱性条件下,硫代硫酸钠及柠  檬酸铁铵成分与沙门氏菌产生的硫化氢反应是的菌落的颜色呈黑色;去氧胆酸盐成分可抑制革兰氏阳性菌的生长。

      •菌落特征:菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心。

XLD琼脂菌落特征——鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028

       7. 沙门氏菌显色培养基

      •蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;胆盐抑制革兰氏阳性菌;选择性添加剂增强培养基的抑制杂菌的能力;混合色素分别与沙门氏菌和大肠菌群所对应的酶发生特异性反应,水解底物,释放出显色基团,在淡黄色平板上沙门氏菌产生品红色的菌落,大肠菌群产生蓝绿色的菌落。

CRM004 沙门显色培养基——鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028

      8. 三糖铁琼脂培养基

      •蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、维生素、矿物质;乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类,其产酸时通过酚红指示剂测出,酸性呈黄色,碱性呈红色;硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢,与硫酸亚铁铵中的铁盐生成黑色硫化铁;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。

三铁塘

      9. 赖氨酸脱羧酶试验培养基

      •具有氨基酸脱羧酶的细菌,能分解氨基酸使其脱羧生成胺(赖氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培养基变碱,使指示剂显示出来。

      •结果判读:阳性为试验管为绿色-蓝绿色,对照管变黄色; 阴性为试验管和对照管均变黄色,或均不变色。

赖氨酸脱羧酶试验阳性

      10. 靛基质试验

      •某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。

      •结果判读:阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色;阴性为滴加试剂后不变红色。

靛基质试验

      11. 尿素酶试验

      •具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素,产生大量的氨,使培养呈碱性,酚红指示剂在pH6.8时呈黄色,pH8.1呈粉红色。

      •结果判读:阳性为玫红色; 阴性为淡橙红色-淡黄色。

尿素酶试验

      12. 氰化钾利用试验

      •氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.。

      •结果判读:阳性为试验管和对照管都有生长变浑浊; 阴性为试验管澄清不见生长,对照管生长浑浊。

氰化钾利用阴性结果

      13. 糖(醇)发酵试验

      •绝大多数细菌都能利用糖(醇)类作为碳源和能源,但是它们在分解糖(醇)的能力上有很大的差异,有些细菌能分解某种糖(醇)并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。

      •(指示剂为溴甲酚紫)结果判读:阳性为变黄色;阴性为紫色。

甘露醇发酵试验

      14. 沙门氏菌属不同生化反应结果出现百分率

实验名称

反应结果

沙门菌比例(%)

三糖铁发酵葡萄糖产酸

阳性

100

三糖铁发酵葡萄糖产气

阳性

91.93

三糖铁发酵乳糖

阴性

99.24

三糖铁发酵蔗糖

阴性

99.5

三糖铁产硫化氢

阳性

91.6

尿素(pH7.2)

阴性

99

赖氨酸脱羧酶

阳性

94.65

ONPG

阴性

98.44

VP

阴性

100

靛基质试验

阴性

98.9

      15. 沙门氏菌判定表

三糖铁

赖氨酸脱羧酶

靛基质

尿素(pH7.2)

补充实验

O与H多价

结果判定

斜面

底层

硫化氢

红色

黄色

阳性

阴性

阴性

无需补充

均凝集

沙门氏菌属

红色

黄色

不产

阳性

阴性

阴性

ONPG阴性

均凝集

沙门氏菌属

黄色

黄色

阳性

阴性

阴性

无需补充

均凝集

沙门氏菌属

黄色

黄色

不产

阴性

无需测试

无需测试

无需补充

无需测试

非沙门氏菌

红色

红色

产/不产

阳性/阴性

无需测试

无需测试

无需补充

无需测试

非沙门氏菌

在接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,一定要注意是同一个菌落,这种实验组合的优势是可筛选掉更多的非沙门氏菌,减少后续工作量。

上述结果判定仅适用于典型沙门氏菌,如出现非典型结果,应进行系统生化鉴定和血清学分型进行确认。

      16. 071740 沙门氏菌生化鉴定盒(接种鼠伤寒沙门氏菌的结果)

       17. EasyID 沙门氏菌生化鉴定盒(接种鼠伤寒沙门氏菌的结果)

四、血清试验

      血清学鉴定中的多价菌体(O)和多价鞭毛抗原鉴定是沙门氏菌鉴定的必做项目,血清学分型为选作试验。实验室必须配备沙门氏菌的多价菌体(O)和多价鞭毛(H)诊断血清。血清学试验必须基于生化结果试验的结果,不能单纯以血清学实验结果来报告最终。

A-F “O”多价血清凝集                     A-F “O”多价血清不凝集

五、沙门氏菌恒温荧光核酸快速检测

六、沙门氏菌检验所需培养基试剂

用途

货号

名称

规格

前增菌

023130

缓冲蛋白胨水(BPW)

  瓶(干粉)250g

CP0680

缓冲蛋白胨水(BPW)

  盒(袋装)225 mL×10袋

CP0290

缓冲蛋白胨水(BPW)

  盒(瓶装)225 mL×6瓶

CP0560A

缓冲蛋白胨水(BPW)

  盒(管装)9 mL×20支

023130P1

缓冲蛋白胨水(BPW)

  瓶(颗粒)250 g

二次增菌

023030

四硫磺酸钠煌绿增菌液基础(TTB)

  瓶(干粉)250g

SR0040

四硫磺酸钠煌绿增菌液配套试剂

  盒(西林瓶)2×5支/盒

CP0300

四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)

  盒(管装)10 mL×20支

023040

亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

  瓶(干粉)250g

CP0050

亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

  盒(管装)10 mL×20支

023040P1

亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

  瓶(干粉)250g

平板分离

023052

亚硫酸铋琼脂(BS)

  瓶(干粉)250g

023070

HE琼脂培养基

  瓶(干粉)250g

CP0110

HE琼脂培养基

  盒(平板)90 mm×20

029999

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD

 瓶(干粉)250g

029999P1

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

 瓶(颗粒)250 g

CP0180

木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂(XLD)

 盒(平板)90 mm×20

CRM004

沙门氏菌显色培养基

 1000 mL

CP0560

沙门氏菌显色培养基平板

 盒(平板)90 mm×20

生化鉴定

022080

三糖铁琼脂(TSI)

 瓶(干粉)250g

CP0080

三糖铁斜面

 盒(管装)20支

022110

蛋白胨水

 瓶(干粉)100g

075240

蛋白胨水

 盒(西林瓶)20支

029230

靛基质试剂

 10 mL×1支/盒

023090

尿素琼脂培养基基础

 瓶(干粉)100g

029100

40%无菌尿素溶液

 盒(西林瓶)2 mL×10支

075150

尿素(冻干)

 10支(冻干)+10支(无菌水)

075330

氰化钾生长实验管

 盒(西林瓶)20支

075340

氰化钾对照管

 盒(西林瓶)20支

生化鉴定

075280

赖氨酸脱羧酶培养基

 盒(西林瓶)20支

075290

氨基酸脱羧酶对照培养基

 盒(西林瓶)20支

029110

无菌石蜡油

10 mL×1支

075090

山梨醇

 盒(西林瓶)20支

075040

甘露醇

 盒(西林瓶)20支

075180

β-半乳糖苷ONPG

 盒(西林瓶)20支

075100

卫矛醇

 盒(西林瓶)20支

075140

水杨素(水杨苷)

 盒(西林瓶)20支

075190

丙二酸盐

 盒(西林瓶)20支

HKI 02

Easy ID沙门氏菌生化鉴定盒(不含三糖铁)

血清学实验验

HM42

沙门氏菌乳胶凝集试剂盒

 50 tests

026050

半固体琼脂

 瓶(干粉)250g

075350A

半固体琼脂

 盒(管装)20支

023118

沙门氏菌鞭毛诱导软琼脂

 瓶(干粉)250g

核酸快速检测试剂盒

KJD05L

沙门氏菌核酸检测试剂盒(恒温荧光法)

 24测试/盒

HANDY PALTE微生物测试片

HP005

沙门氏菌检测片

 20片/包



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