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食品微生物检验GB4789.3-2016大肠菌群计数及注意事项

发布时间:2020-08-28      浏览次数:3525    分享:

一、大肠菌群定义和卫生学意义

大肠菌群定义:在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群不是细菌学上分类命名,它不代表某一种或某一属的细菌,而是一组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括:埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属、肠杆菌属(又叫产气杆菌属,包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)和等。

卫生学意义:大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。表示了对人体健康是否具有潜在的危险性。直接反映了样品受粪便污染的的程度。


二、GB4789.3-2016大肠菌群MPN法

1.  什么是MPN法?

•MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

•MPN值并不能表示实际菌落数, 实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点,MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。

•灵敏度较高,适用于污染菌落较少的样品。

2. 大肠菌群MPN计数的检验操作


3. 培养基原理解析

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

•月桂基硫酸盐能抑制革兰氏阳性菌生长,胰蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;氯化钠可维持均衡的渗透压;乳糖是大肠菌群可发酵的糖类;磷酸二氢钾和磷酸氢二钾是缓冲剂。

•36±1℃培养24h后若已产气,则可停止培养。如果没有观察到有产气的现象,则继续培养至48±2h。

•如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤。

-                                         +

煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

•胆盐与煌绿均能抑制革兰氏阳性菌生长。

•培养基配方当中含有胆盐,大肠菌群发酵乳糖所产的酸会与胆盐发生反应,形成胆酸沉淀。培养基可由原来的绿色变为黄色。

阴性                                 阳性

4. 大肠菌群最大可能数(MPN)报告

•确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表,报告每1g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

•当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值时,如:阳性管数为122,123,232,233等时,建议增加稀释度(可做4~5个稀释度),使样品最高稀释度能达到阴性终点(如果污染程度不能判定,则多加一稀释度),然后再遵循相关的规则进行查找,最终确定MPN值。

表:大肠菌群最可能数(MPN)检索表

阳 性 管 数


MPN

95%可 信 限

阳 性 管 数


MPN

95%可 信 限

0.10

0.01

0.001

下 限

上 限

0.10

0.01

0.001

下 限

上 限

0

0

0

<3.0

9.5

2

2

0

21

4.5

42

0

0

1

3.0

0.15

9.6

2

2

1

28

8.7

94

0

1

0

3.0

0.15

11

2

2

2

35

8.7

94

0

1

1

6.1

1.2

18

2

3

0

29

8.7

94

0

2

0

6.2

1.2

18

2

3

1

36

8.7

94

0

3

0

9.4

3.6

38

3

0

0

23

4.6

94

1

0

0

3.6

0.17

18

3

0

1

38

8.7

110

1

0

1

7.2

1.3

18

3

0

2

64

17

180

1

0

2

11

3.6

38

3

1

0

43

9

180

1

1

0

7.4

1.3

20

3

1

1

75

17

200

1

1

1

11

3.6

38

3

1

2

120

37

420

1

2

0

11

3.6

42

3

1

3

160

40

420

1

2

1

15

4.5

42

3

2

0

93

18

420

1

3

0

16

4.5

42

3

2

1

150

37

420

2

0

0

9.2

1.4

38

3

2

2

210

40

430

2

0

1

14

3.6

42

3

2

3

290

90

1000

2

0

2

20

4.5

42

3

3

0

240

42

1000

2

1

0

15

3.7

42

3

3

1

460

90

2000

2

1

1

20

4.5

42

3

3

2

1100

180

4100

2

1

2

27

8.7

94

3

3

3

>1100

420

注1:本 表 采 用3个 稀 释 度[0.1g(mL)、0.01g(mL)、0.001g(mL)],每 个 稀 释 度 接 种3管 。

注2:表 内 所 列 检 样 量 如 改 用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表 内 数 字 应 相 应 降 低10倍;如 改 用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则 表 内 数 字 应 相 应 增 高10倍,其 余 类 推 。

三、GB4789.3-2016大肠菌群计数平板法

1. 大肠菌群平板计数法流程图

2. 培养基原理解析

结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

•配方中胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌,中性红作为指示剂,在酸性条件下为紫红色。

•大肠菌群分解乳糖所产的酸与胆盐结合,可形成粉红色菌落菌落周围有胆酸盐沉淀环。

•该培养基无需高温高压灭菌,现配现用。

大肠埃希氏菌ATCC25922在VRBA上的菌落形态

3. 计数典型和可疑菌落数

结果判读:选取菌落数在15 CFU~150 CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm或更大。

证实试验:从各样品中接种同一样品浓度的VRBA平板上共挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24 h~48 h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。

4. 大肠菌群平板计数的报告

•经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

•若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则小于1乘以最低稀释倍数计算。

四、质量控制

1. 实验室过程中,每批样品稀释液都要做空白对照。 

2. 为了控制环境污染,每次检验过程中,于检验台上打开两块计数琼脂平板,并在检验环境中暴露不少于15分钟,将此平板与本批次样品同时进行培养,以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。 

3. 定期使用大肠埃希氏菌ATCC25922或相应定量活菌参考品,在P2实验室或阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性实验验证,并进行记录,次验证实验至少每2个月进行1次。

五、大肠菌群测试片法

1.  原理:大肠菌群检测片由轻便防水纸质材料做支撑,其上覆盖干燥培养基层(营养物质、凝固剂、选择抑制剂、显色剂)和透明隔水膜组成,经辐照灭菌。可用于食品、饮料等的大肠菌群计数。含有四氮唑指示剂菌落为红色,发酵乳糖产酸和产气。

2. 特点优势

•菌落计数特别方便(容易判读),红色菌落,易于食品颗粒分开,无菌落重叠现象;

•菌落分布特别均匀;

•避免了培养基对细菌热损伤有关;

•菌落蔓延或半透明菌膜现象很少发生

•经济环保 无粉尘,体积小,重量轻,易储运 

•保质期长干制无水培养基,性质稳定,保质期更长

六、所需培养基试剂和质控菌株

用途

货号

名称

规格

样品稀释

CP0630

生理盐水

盒(袋装)225 mL×10袋

CP0511A

磷酸盐缓冲液(PBS)

盒(瓶装)225 mL×6瓶

CP0640

磷酸盐缓冲液(PBS)

盒(袋装)225 mL×10袋

022117

磷酸盐缓冲液(PBS)

瓶(干粉)250 g

CP0310

生理盐水

盒(管装)9 mL×20支

MPN法计数初发酵试验

022210

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

瓶(干粉)250g

022210P1

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

瓶(颗粒)250 g

022210A

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)

盒(管装)10 mL×20支

22210G1

双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤

盒(管装)10 mL×20支

平板计数

022221

结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

瓶(干粉)250g

022221P1

结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

瓶(颗粒)250g

C22221B1

结晶紫中性红胆盐琼脂平板

盒(平板)90 mm×20

MPN法复发酵和平板计数证实

022220

煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

瓶(干粉)250g

022220P1

煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

瓶(颗粒)250g

022220A

煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)

盒(管装)10 mL×20支

HANDYPLAT微生物测试片

HP002

大肠菌群测试片

20片/包

Q-Strain定量质控菌株

QS011A

大肠埃希氏(ATCC25922)

110-1100 CFU/瓶

QS011B

大肠埃希氏菌(ATCC25922)

(0.6-2.0)×107CFU/瓶


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