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GB 4789.4沙门氏菌检测注意事项

发布时间:2019-11-07    浏览次数:71

一.沙门氏菌检测的原因和意义

据统计我国细菌性食物中毒中70%~80%是由沙门氏菌引起的,人一旦摄入含有大量沙门氏菌(10E5~10E6个/g)的动物性产品,就会引起细菌性感染,进而在毒素作用下发生食物中毒导致胃肠炎、伤寒和副伤寒且沙门氏菌的传播媒介众多,肉、蛋以及食品从加工到出售的过程中都十分容易发生污染。因此对沙门氏菌检测事关重大。

二.沙门氏菌检测的环境

沙门氏菌检测要在二级生物安全实验室及二级生物安全柜(在负压情况下防止致病微生物气溶胶飘离实验室对实验人员及环境造成污染)中进行。

三.沙门氏菌检测过程中的相关培养基试剂解读

1.前增菌(无选择性):

缓冲蛋白胨水(BPW)是基础增菌培养基,不含任何抑制成分,有利于受损伤的沙门氏菌复苏。使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。

2.选择性增菌:

四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)中的硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可抑制肠道共生菌,而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌能在此培养基中繁殖;胆盐和煌绿可抑制大肠群菌和其它革兰氏阳性细菌生长,而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长。亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)可对伤寒及其他沙门氏菌作选择性增菌,其成分中的亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合,形成亚硒酸和硫的复合物,影响细菌硫代谢,从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。

3.分离培养基(选择性):

①亚硫酸铋琼脂(BS)中的亚硫酸铋指示剂抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群,但不影响沙门氏菌的生长;伤寒杆菌及其他沙门氏菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋,形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环,对光观察可见有金属光泽。

注意

BS不能高压,不能过分加热,以免降低其选择性,应在临用时配制,保存在阴暗处,48h后失去选择性,保存不当导致颜色变浅说明已经开始减效,与TTB(TTB的添加剂必须在棕色瓶储存,不能见光,否则选择性减弱。TTB有用于消除和吸收有毒代谢产物的碳酸钙容易产生沉淀,分装时一定要摇匀。TTB加入添加剂后就不能再加热。)或SC(SC中含有剧毒物质亚硒酸氢钠,使用时候要注意安全,当天使用当天配置。)合用可获得更高的检出率。

沙门氏菌在BS琼脂上的菌落形态:产H2S的菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色。菌落周围培养基可呈黑色或棕色,有些不产H2S的菌落,形成灰绿的菌落,周围培养基不变。

②HE琼脂中的胆盐、去氧胆酸钠、溴麝香草酚兰和酸性复红抑制革兰氏阳性菌生长;硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测H2S的产生,使菌落中心呈黑色;溴麝香草酚兰和酸性复红为pH指示剂,发酵糖产酸的菌落呈橙-黄色,不发酵糖的菌落为蓝绿色。

注意

HE不能高压灭菌,煮沸不能超过1min,水浴中冷却,只能保存一天。

沙门氏菌在HE琼脂上的菌落形态:蓝绿色或蓝色,多数菌株产H2S,中心呈黑色或几乎全黑色。有些菌株为黄色,中心呈黑色或几乎全黑色。

③XLD琼脂中的去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌生长,在此浓度下也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂但不影响沙门氏菌和志贺菌属的生长的生长;硫代硫酸钠可被某些细菌还原成H2S,与柠檬酸铁铵中的铁盐生成黑色硫化铁。

注意

XLD平板培养基不能高压,不能过热煮沸,保存一天。XLD培养基分离沙门氏菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基,如:EMB、SS、BS。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素,故本培养基是分离鉴定沙门氏菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。

沙门氏菌在XLD平板培养基上的菌落形态:粉红色带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心或呈现全部黑色的菌落;有些菌落为黄色,带或不带黑色中心。

④沙门氏菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门氏菌。其基本原理是利用沙门氏菌特异性酶与显色基团的特有反应,使色原游离出来,从而使沙门氏菌在培养基上呈现特定的颜色(具体颜色查看相关品牌显色培养基使用说明书)而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈其他颜色。

四.沙门氏菌检测过程中的注意事项和常见问题

1.前增菌和二次增菌都是必不可少的过程。

食品中的沙门氏菌含量一般都很少并且会有多种细菌同时存在的情况,前增菌可以使受伤菌得到修复而增菌可以抑制一些杂菌的生长,所以沙门氏菌检测用前增菌和增菌分别进行筛选和培养,可以增加后期分离培养的检出率。

2.在沙门氏菌检测分离培养中应注意当不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时,按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。 
       HE和XLD:非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落,带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后,没有典型的沙门氏菌菌落,则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。
       BS琼脂:某些非典型菌株产生绿色菌落,其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后,没有出现典型菌落,则不挑取任何菌落让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后,仍没有典型或可疑菌落出现,则挑取2个或更多个非典型的菌落。 

3.TSI要制备成高柱斜面,有助于结果判读,实验时应先划线再穿刺,先穿刺再划线可能会导致含菌量太高。

如果产H2S变黑,难以观察底层的产酸现象,并且如果产气较多的话培养基会被顶出很高更有甚者可能会顶开试管塞。典型沙门氏菌在TSI上斜面呈红色,底端呈黄色,有气体产生,90%形成H2S,琼脂变黑。但对于乳糖阳性的沙门氏菌斜面也呈黄色,因此不能仅仅根据三糖铁培养的结果就确认沙门氏菌。

4.目前没有一种培养基能准确无误的筛选出沙门氏菌,因此必须选择多种选择性培养基同时进行筛选。

显色培养基只是综合选择性更强,实验人员不能只在选择性培养基和TSI 特征符合而没有把关键的生化反应和血清学鉴定完成的情况下就报结果,这样很可能导致结果假阳性。

5.血清学鉴定是沙门氏菌检验中的重要鉴定方法。

包括菌体抗原(O)鉴定、鞭毛抗原(H)鉴定和Vi抗原鉴定。血清检测时要使用24h内的纯菌,在规定时间内观察结果,并做自凝实验。凝集不好的室温(不要放冰箱)放置1-2天或者传代一次再凝集,可能凝集的情况会好些。如果实验室条件许可建议购置进口血清(以泰国和丹麦血清为佳),如果用国产血清尽量同时使用两种厂家产品互相验证。

6.沙门氏菌结果判定应该以生化试验结果为主并在此基础上进行血清学判定。

直接用多价血清进行试验而不进行生化试验是绝对不可取的。因为血清学的原理是抗原抗体结合,非沙门氏菌的微生物也有可能带有沙门的类似抗原,这样的操作可能会导致假阳性因此我们做鉴定的时候必须先进行生化试验,再在生化试验的基础上进行血清学鉴定。

7.如果我们只需要鉴定某个菌株是否属于沙门氏菌,那只需要做O多价和H多价血清就可以了(大多数食源性沙门氏菌凝集A-F群O多价)。

如果要鉴定某个菌株具体是什么沙门氏菌,那就需要进行血清学分型试验,从多价血清一直做到O抗原和H抗原的单因子,然后参照《GB 4789.4-2016  食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》附录B的表格查找对应的沙门氏菌名。

8.在做血清学鉴定时O多价血清如果没有凝集并不能直接判定为阴性,因为还要考虑Vi抗原的影响。

Vi抗原属于K抗原群会阻隔O抗原和相应抗体的结合,所以当Vi抗原存在时,O多价血清是不会凝集的。因此必须去除Vi抗原的影响。具体方法是挑取菌苔于1ml生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查如果还是不凝集,才能判定为阴性。